免疫熒光法的注意事項

    免疫熒光技術又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展zui早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。
    免疫熒光技術按原理可分為直接法和間接法。所謂直接法就是將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經過一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。
    那么在進行直接免疫熒光法的操作時，有哪些是需要我們注意的呢？
    1.對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過1:20，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，影響觀察的結果;
    2.染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原的變化，染色時間可以從10min到數小時，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25°C左右），高于37°C可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2°C的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37°C30min效果好的多;
    3.為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
    1)標本自發熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS;
    2)特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體;
    3)陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。
    如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。
    4.一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現象，經熒光染色的標本zui好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。
    間接法就是在檢查位置抗原時，先用已知未標記的特異抗體（di一抗體）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗原-抗體-抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查位置抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為di一抗體，其他步驟的抗原檢查相同。
    標記的抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血球蛋白只對雞的球蛋白發生反應，因此，制備標記抗體適用于雞任何抗原的診斷。
    操作間接免疫熒光法時我們應注意以下幾點：
    1.熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4°C保存4h，時間過長，會使熒光減弱;
    2.每次試驗時，需設置以下三種對照：
    1)陽性對照：陽性血清+熒光標記物
    2)陰性對照：陰性血清+熒光標記物
    3)熒光標記物對照：PBS+熒光標記物
    3.已知抗原標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥;
    4.所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物，應始終保持在已知抗原標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。