避免熒光串色的方法

    在用熒光顯微鏡對樣品進行觀察時，兩種或兩種以上熒光素之間，如果熒光發(fā)射峰很近，那么熒光光譜彼此會有部分重疊，檢測到可能出現(xiàn)一種熒光素的信號擴散到另一熒光通道的情況。這種現(xiàn)象稱為串色或熒光光譜交叉（crosstalk）。避免或排除光譜交叉干擾的方法通常有以下幾種：
    1）使用幾種熒光素時，盡量選擇之間無光譜交叉的熒光素。
    2）降低標記熒光強度：樣品的一種或幾種熒光強度太高，有時會導(dǎo)致光譜交叉出現(xiàn)。采用降低標記物濃度、縮短標記時間及調(diào)整熒光素介質(zhì)等方法可降低樣品熒光強度。
    3）采用序列掃描方法：主要是指用不同波長激光輪流照射樣品，同時在相應(yīng)的熒光檢測通道輪流采集，并顯示每種熒光的共聚焦圖像。對于雙重?zé)晒馊旧珮悠菲渚唧w操作過程時：首先只用一種激光激發(fā)相應(yīng)的di一種熒光物質(zhì)，在di一通道顯示其熒光圖像；再用另一種激光激發(fā)另一種熒光物質(zhì)，在第二通道顯示其熒光圖像。相應(yīng)的順序掃描軟件能夠?qū)赏ǖ赖牟煌瑹晒鈭D像同時分通道顯示并疊加合成，展示出兩次熒光間空間定位關(guān)系。以此類推，用順序掃描方法還可以采集三重或更多重?zé)晒鈽悠返膱D像。
    4）修改光譜檢測的檢測條件：在圖像上出現(xiàn)比較弱的熒光交叉信號時，可通過改變儀器的檢測條件來克服，常用的措施有：
    a.降低干擾熒光的激發(fā)強度以降低其發(fā)射熒光強度；
    b.減小被干擾通道的檢測靈敏度；
    c.改變激發(fā)光波長和檢測波長范圍等。例如在熒光通道2的圖像上看到來自通道1的較弱的熒光交叉信號，這時，在保證采集到各通道清晰圖像的情況下，降低通道1的激發(fā)強度，減小通道2的光電倍增管效能以降低其采集的靈敏度，小范圍內(nèi)改變各通道的檢測波長，可以消除來自通道1的熒光交叉信號。
    5）熒光光譜鑒別法：通常情況下，不同熒光物質(zhì)的熒光光譜不會完全重疊，利用不同熒光光譜之間的差異，可以將來自兩種熒光物質(zhì)的熒光信號鑒別開來，得到各自的熒光圖像。