熒光顯微鏡壽命成像原理

      熒光壽命是指分子受到光脈沖激發后返回基態之前在激發平均停留的時間，處于激發態的熒光分子在從激發到基態的過程中發射熒光釋放能量。熒光壽命取決于熒光分子所處的微環境，通過對樣品熒光壽命的測量和成像可以定量獲取樣品的功能信息。
   

    熒光壽命成像技術有兩種：時間域和頻率域。
   

  （1）時域FLIM：需要脈沖光源，所以一般在雙光子的系統上比較常見FLIM（熒光壽命成像Fluorescence Life-time imaging Microcopy簡稱FLIM），理由一是激光是脈沖的，二是買雙光子的老師一般也搭配一個FLIM。如果是在單光子系統上的話，就需要買可見光波段的pulsed laser了。光路調節也是一個問題，提供的廠家一般是Becker&Hickl,和PicoQuant，德國公司。這個方法比較流行，也有很多系統。
   

  （2）頻域FLIM：需要一個相位調制的光源，有用LED調制的，荷蘭的Lambert-Instrument就有這樣一套產品，是在wide-field的熒光顯微鏡上搭的，也有在共聚焦上的。
    FLIM對很多研究都有幫助，只是在生物領域的影響力不大，都是一些物理背景的科研人員在做。覺得用ＦLIM-FRET的方法得出結果，比單純intensity FRET拿到的數據可靠得多。
   

以下為熒光壽命成像FLIM的應用：
    1）細胞體自身熒光壽命分析；
    2）自身熒光相對熒光標記的有效區分；
    3）具有相同頻譜性質的不同熒光標記的區分；
    4）活細胞內水介質的PH值測量；
    5）局部氧氣濃度測量；
    6）活細胞內鈣濃度測量；
    7）時間分辨Forster共振能量轉移（FRET）：納米級尺度上的遠程測量，環境敏感的FRET探針定量測量。